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當(dāng)前位置:首頁(yè)資料下載鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)生化試劑盒說(shuō)明書(shū)

鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)生化試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/3/31點(diǎn)擊次數(shù):756

鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                    微量法100T/96S

 

   正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是以鳥(niǎo)氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

 

測(cè)定原理:

鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸在鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADH作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時(shí)產(chǎn)生NAD,通過(guò)檢測(cè)340nm處的吸光度的變化可反映出鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、研缽、酶標(biāo)儀、96孔板

 

試劑組成和配制:

提取液:液體110mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體30 mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。

試劑四:粉劑×2瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加4mL試劑一充分溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

酶液提取:

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

3.        液體:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定操作:

1.        酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm

2.        將配好的試劑二、三、四37℃預(yù)熱5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制)

3.        96孔板,依次加入60μL試劑二,60μL試劑三,60μL試劑四,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處初始吸光值和37℃反應(yīng)10min的吸光值A2,△A=A1-A2

4.        計(jì)算公式:

 

 

96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計(jì)算

 

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OATnmol/min /mg prot=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OATnmol/min /g 鮮重=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

 

3)按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OATnmol/min /104 cell= ΔA÷ε×d×V反總÷(V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4)按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OATnmol/min /mL)=ΔA÷ε×d×V反總÷V÷T

=321.54×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mLεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間,10 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g

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