中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書

                                                 微量法 100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養保健品生產。

測定原理：

中性條件下，NP催化酪蛋白水解產生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；在680nm有特征吸收峰。        

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、1.5 mL EP管和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加20mL蒸餾水溶解。

試劑五：液體4mL×1瓶，4℃保存。

標準品：液體1mL×1支，0.25μmol/mL標準酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

2.        血清或培養液：直接測定。

3.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到680 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

3. 對照管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，

記為A對照管。

4. 測定管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取0.5 mL EP管，加入40μL蒸餾水，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A空白管。

6. 標準管：取0.5 mL EP管，加入40μL標準品，200μL試劑四，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收，記為A標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

計算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計算

NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /mg prot）= C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷Cpr

2．按照樣本質量計算

NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /g鮮重）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷W

3. 按照液體體積計算

NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min/mL）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷V1÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）

4.         

5.        按照細胞數量計算

NP活性單位定義：30℃每10⁴個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

NP活性（nmol/min /10⁴ cell）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷（細胞數量×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷細胞數量

C標準品：0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液；V反總：酶促反應總體積，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），0.02 mL；V2：提取液總體積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min；W：樣品質量（g）。

注意事項：

臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3天內使用完畢。