亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書

 微量法100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內，是自然界氮循環過程中的關鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環境中亞硝態氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

測定原理：

亞硝酸還原酶可將NO₂^—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO₂^—減少，即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品：天平、研缽、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。

試劑的組成和配制：

提取液：液體112mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）  

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2．細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作表：

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R² = 0.9997；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（V樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷W

3. 按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個細胞每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷細胞數量

V標：標準液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R² = 0.9997；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（V樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷W

3. 按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個細胞每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷ 細胞數量

V標：標準液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g

注意事項：

1.        配制好的工作液3天內使用完。

2.        若吸光值超過1.5，將上清液進行適當的稀釋后再加入工作液顯色，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

3.        嚴格控制顯色時間，否則會對結果有影響。

4.        標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5.        A空白管-（A測定管-A對照管）線性范圍為0.02-1.5。