腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒說明書

                                  微量法100管/96樣

注   意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測定原理：

AGP催化的逆向反應生成G1P，在反應體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算AGP活性。

需自備的的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入9mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

粗酶液制備 ：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置30℃保溫10min以上。

3、在EP管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫15 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃離心5min，

取上清液，在96孔板中依次加入下列試劑

混勻后，立即于340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

AGP活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

               =2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

               =2813×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

               =5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

               =5627×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。