NAD激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                               微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或無(wú)機(jī)多聚磷酸[poly(P)]作為磷酰基供體進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測(cè)定原理：

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；在340 nm下測(cè)定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一和試劑二37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入5mL試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

   工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入18mL試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min，立即煮沸

2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心10min，取上清

加完試劑混勻，室溫靜置15min，340nm下測(cè)定吸光值，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。

NADK活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADK活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=53.59×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADK活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.  

c. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADK活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=107.18×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADK活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=107.18×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.214×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。