總膽固醇（total cholesterol，TC）含量測(cè)定試劑盒說明書

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TC包括游離膽固醇和膽固醇酯。TC是指組織中所有脂蛋白所含膽固醇之總和。

測(cè)定原理：

利用酯酶催化膽固醇酯水解生成游離膽固醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽固醇酯轉(zhuǎn)化為FC；進(jìn)一步利用膽固醇氧化酶催化FC氧化，生成△4-膽甾烯酮和H₂O₂；最后利用過氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林和酚，生成紅色醌類化合物；在500nm有特征吸收峰，其顏色深淺與TC含量成正比。

自備儀器和用品：

水浴鍋、可調(diào)式移液槍、酶標(biāo)儀、96孔板。

試劑組成和配置：

試劑一：異丙醇100mL（自備）；

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體40μL×1瓶，4℃保存；

TC標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，0.5μmol/mL，4℃保存。

TC的提取：

1、組織中TC的提取：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清，即TC待測(cè)液。

2、細(xì)胞、細(xì)菌中TC的提取：先收集400-500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加1mL試劑一，超聲波破碎1min（強(qiáng)度20％，超聲2s，停1s），即TC待測(cè)液。

3、血清（漿）等樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1. /酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到500 nm。

2. TC工作液的配制：臨用前，吸取約0.8mL試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中，充分溶解后再全部轉(zhuǎn)移回試劑二瓶中，充分混勻，TC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在96孔板中加入20μL FC標(biāo)準(zhǔn)液和180μL TC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：依次在96孔板中加入20μL FC待測(cè)液和180μLTC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A測(cè)定管。

5. 空白管：依次在96孔板中加入20μL 試劑一和180μLTC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A測(cè)定管。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

1. 血清（漿）中TC含量計(jì)算：

TC（μ mol /dL）=C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×100

=50×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL；100 mL：1dL=100 mL。

2. 組織中TC含量計(jì)算：

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

TC（μ mol / mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

   = 0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

TC（μ mol / g 鮮重）= C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

   = 0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL；樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL

3. 細(xì)胞、細(xì)菌中TC含量計(jì)算：

TC（μ mol /10⁴ cell）=C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷細(xì)菌或細(xì)胞（10⁴ cell /L）

   =0.5×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷細(xì)菌或細(xì)胞（10⁴ cell /L）

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL。

Z低檢出限為1nmol/mL。