谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。

測定原理：

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時(shí)NADPH脫氫生成NADP⁺；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計(jì)算GR活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配置：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min。

3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，于340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2。

注 意：

1.加完上清液后必須迅速混勻測定，保證準(zhǔn)確測出初始反應(yīng)速度；

2.當(dāng)出現(xiàn)初始180s內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時(shí)，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間，選取相對穩(wěn)定的時(shí)間段內(nèi)吸光值變化值；

3.當(dāng)所測△A測定管的值在零點(diǎn)附近徘徊時(shí)，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進(jìn)行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變化區(qū)間過小無法準(zhǔn)確測出，建議樣本稀釋2~5倍后再進(jìn)行測定)

計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷[Cpr×V樣]÷T

= 536×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 536×△A測定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T           

= 536×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷×V樣÷T

= 536×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹]÷[Cpr×V樣]÷T

= 1072×△A測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 1072×△A測定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T           

=1072×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁹]÷×V樣÷T

=1072×△A測定管

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4

L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。

注意事項(xiàng)：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；

（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完。

（3）測定前須先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。

（4）細(xì)胞中GR活性測定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GR的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。