組織無機磷含量測定試劑盒說明書

                                                微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

無機磷主要指磷酸根，參與生物體內多種代謝，包括能量代謝、核酸代謝、蛋白質磷酸化和脫磷酸化等等，此外促進碳水化合物的合成、轉化和轉運。

測定原理：

鉬藍與磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物質，通過測定660nm光吸收，即可計算無機磷含量。

自備儀器和用品：

離心機、水浴鍋、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前配制，加入10 mL蒸餾水，充分溶解后加入試劑二（全部），混勻。

標準品：液體×1支。

無機磷提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到660 nm，蒸餾水調零。

2.打開水浴鍋，調節溫度到40℃。

3. 空白管：取0.5mL EP管，依次加入100μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測定吸光度，記為A空白管。

4. 標準管：取0.5mL EP管，依次加入10μL標準液，90μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測定吸光度，記為A標準管。

5. 測定管：取0.5mL EP管，依次加入10μL上清液，90μL蒸餾水，100μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10 min后于660 nm測定吸光度，記為A測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

組織無機磷含量計算：

（1）         按照蛋白含量計算

無機磷含量(μmol/mg prot)= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷Cpr

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷Cpr

(2)  按照樣本質量計算

無機磷含量(μmol/g 鮮重 )= [C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷W

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷W

C標準液：1mmol/L；V總：上清液總體積，1mL=0.001 L；W：樣品質量，g。

注意事項：

1.        試劑三需臨用前配制，并且當天使用完畢。

2.        40min內完成比色。

3.        Z低檢出限為10μmol/L。