3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）

試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關鍵酶，廣泛存在于動植物和微生物體內，催化1，3-二磷酸甘油酸轉變為3-磷酸甘油酸，產生1分子ATP，具有影響DNA復制和修補及刺激病毒RNA合成等生物學功能，廣泛應用于藥物靶標設計。

測定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP產生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH作用下產生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm處的吸光度變化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×2瓶，4℃保存。 

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加4 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

酶液提取：

①總PGK酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，500g離心5min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體PGK酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液），冰浴勻漿后于4℃，500g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿PGK酶活性，取沉淀加1mL提取液，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，500g離心5min，取上清測定葉綠體中PGK酶活性。

建議測定總PGK酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的PGK，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作：

1.        分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，10μL試劑三，10μL試劑四，40μL試劑五，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2

計算公式

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

b.       用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g