尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）試劑盒說明書

                                                       微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

UDPG焦磷酸化酶是生物體糖原合成過程中的關鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG）。

測定原理：

UGP可逆催化反應生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板

試劑組成和配制： 

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑五：液體2mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

2.        細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

3.        液體：直接檢測。

測定操作：

1.        紫外分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL試劑五，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值A1和330s的吸光值A2，△A=A2-A1

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=643.08×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

UGP（nmol/min /mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=643.08×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g