脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測定試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

AsA作為植物細胞一個重要生理指標，其AsA 的含量、氧化還原狀態(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關酶類活性的變化涉及植物對一系列環境脅迫的響應。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統，具有電子受體的作用。

測定原理：

DTT還原DHA生成AsA，通過測定體系中AsA的生成速率，即可計算出DHA含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體16mL×1瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。

標準品：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解；吸取0.1 mL上述溶液，加入0.9 mL蒸餾水，混勻，即為100μmol/L DHA。

樣品中DHA提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；12000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

DHA測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到265 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3. 標準管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL標準液、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4，△A測定管=A4-A3。

注意：標準管只需測定一次。

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標準管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷W

(3). 按細胞數量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷細胞數量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標準管

C標準液：100μmol/L；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=1 ×10^-3 L；V標準：加入標準品體積，0.02mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量（g）。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

DHA(nmol/mg prot) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測定管÷△A標準管÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷W

(3). 按細胞數量計算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測定管÷△A標準管÷細胞數量

（4）按液體體積計算

DHA(nmol/mL) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷V樣

=100×△A測定管÷△A標準管

C標準液：100μmol/L；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=1×10^-3 L；V標準：加入標準品體積，0.02mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量（g）。

注意事項：

1.        臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內使用完。

2.        Z低檢出限為10μmol/L。