豬細小病毒(PPV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

通用名稱：豬細小病毒(PPV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

Name ：Porcine Parvovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

豬細小病毒（Porcine parvovirus, PPV）是引起母豬流產和新生仔豬死亡的主要病原體之一，同時也能引起某些皮膚病和腹瀉[1-2]，嚴重影響豬群的健康和正常生產，己經給世界養豬業造成了很大的經濟損失。本病主要表現為流產、產死胎和木乃伊胎，母豬通常不表現臨床癥狀。實時熒光定量 PCR 將常規 PCR 技術與熒光檢測相結合,不僅具有敏感性高、特異性強、用時短等優點,而且通過分析軟件對數據進行分析整理，結果更為準確直觀, 已成為病原體檢測的重要方法[3]。

本試劑盒適用于檢測腸系膜淋巴結、肝臟、腎、肺、肝、腦、睪丸、胎盤的肺和淋巴結、全血等樣本中的豬細小病毒，用于豬細小病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對豬細小病毒特異性引物，結合一條特異性探針， 用熒光 PCR 技術對豬細小病毒的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

疑似感染仔豬取腸系膜淋巴結或肝臟；流產或死胎的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤肺、淋巴結等組織；待檢   活豬，用注射器取血 5mL

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區）

1.1  樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術/剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于滅菌離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用公司生產的 DNA/提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操

作。

2.  試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1  將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2  設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環參數設置：

5.  結果分析判定

5.1  結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內調節）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內調節），以及 Threshold的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2  結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質控標準

陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3. 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7. 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，混勻并短暫離心；

3. 反應液應避光保存；

4. 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]  Mengeling W L. Prevalence of porcine parvovirus induced reproductive; an abattoir study [J]. Am Vet Med Assoc, 1978, 172: 1291-1294.

[2]  Den S. Parvovirus-like particle associated with diarrhea in unweaned piglets [J]. Can Comp Med, 1985, 49: 343-345. [3]殷 震,  劉景華. 動物病毒學[M] . 2 版.  北京: 科學出版社, 1997.

[4] 國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 1919-2016 豬細小病毒病檢疫技術規范[S].