新型布尼亞病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

產品名稱：新型布尼亞病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

英文名稱：Novel Bunyavirus Probe qRT-PCR Kit

新型布尼亞病毒，衛生部門從蜱蟲中毒者體內分離出的病毒。或將被認定為一種新型病毒。從目前來看，這一病毒主要由蜱傳播，且可以治療，病死率很低。目前未發現人傳染人的病例。布尼亞病毒自然感染見于許多脊椎動物和節肢動物 (蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，并能在一些哺乳類、鳥類和蚊細胞培養中生長;   對人可引起類似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞─剛果出血熱等)及腦炎(加利福尼亞腦炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒 3 種傳播類型。本產品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測新型布尼亞病毒的試劑盒， 它具有下列特點：

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.    引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.    提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據新型布尼亞病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的

RNA 發生交叉反應。

5.    本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6.    本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】

樣品 RNA。

【注意事項】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.    在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.   重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.    如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽

性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL 陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA/提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

11.    蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qRT-PCR：

五、數據處理

12.    如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.    如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。