漆酶（Laccase）試劑盒說明書

                                                微量法 100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，廣泛分布于真菌和高等植物中，具有較強(qiáng)的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維素降解以及生物檢測(cè)方面有非常廣泛的應(yīng)用。

測(cè)定原理：

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS，測(cè)定ABTS自由基的增加速率，可計(jì)算得漆酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存。

工作液：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加15mL試劑一溶解；用不完的試劑4℃保存一周。

酶液提取：

1．   組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心30min，取上清，置冰上待測(cè)。

2．   細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3．   細(xì)胞培養(yǎng)液：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

注意：

1、   極少數(shù)樣本在60℃水浴20min后會(huì)出現(xiàn)沉淀，可經(jīng)過8000g 25℃離心10min后，取上清檢測(cè)，例如成

      熟的水稻葉片樣本。

2、   為確保檢測(cè)準(zhǔn)確性，若ΔA大于1，將樣本用提取液稀釋2~10倍后重新檢測(cè)，計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

酶活性計(jì)算公式：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 9.26×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T= 9.26×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 9260×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.3mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18.52×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 18.52×△A÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 18.52×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反總÷V樣÷T= 18520×△A

ε：ABTS毫摩爾消光系數(shù)：36L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.3mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.045mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min